Les protéines kinases jouent un rôle vital dans la régulation de la croissance, de la prolifération et de l’immunité cellulaire en phosphorylant les protéines. La dérégulation des kinases est associée à diverses maladies. Pour étudier l’activité kinase, divers dosages ont été développés. Cette présentation donne un aperçu des méthodes de dosage d’activité kinase et de leurs applications.

Il existe différents types de protéines kinases humaines, notamment AGC, CaM, CK1, CMGC, STE, TK et TKL. Chaque groupe a des caractéristiques et des fonctions distinctes dans les voies de signalisation cellulaire.

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Les enzymes kinases catalysent le transfert de groupes phosphates de molécules à haute énergie vers des substrats spécifiques

Les kinases sont impliquées dans divers processus cellulaires, tels que la synthèse des protéines, la division cellulaire, l’apoptose et le vieillissement. Ils jouent également un rôle crucial dans des maladies comme le cancer, le diabète, l’hypertension, la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer.

Dosage radiométrique de l’activité kinase

Traditionnellement, des dosages radiométriques utilisant de l’ATP marqué au 32P ont été utilisés pour mesurer l’activité kinase. Cette méthode utilise le SDS-PAGE et l’autoradiographie pour visualiser et quantifier la phosphorylation des protéines.

Détection fluorescente

Les dosages fluorescents fournissent une alternative aux méthodes radioactives. Ils utilisent des sondes fluorescentes pour détecter l’ADP, un produit de la phosphorylation de la kinase. Ces tests offrent un suivi en temps réel et peuvent cribler des bibliothèques de composés pour des modulateurs de kinase potentiels. Les dosages HTS sont également disponibles pour le criblage à haut débit.

Détection luminescente

Les dosages basés sur la luminescence utilisent la luminescence liée à l’ADP pour mesurer l’activité kinase. Ils utilisent une réaction luciférase-luciférine pour détecter l’ATP nouvellement synthétisé. Ces tests sont très sensibles, à haut débit et peuvent être utilisés pour d’autres enzymes génératrices d’ADP.

Amplification en chaîne polymérase qualitative (qPCR)

La qPCR est une technique sensible, qui quantifie l’activité kinase en détectant les marqueurs d’ADN associés. Elle peut mesurer la quantité de kinase capturée dans les échantillons, et déterminer les constantes de dissociation pour les interactions kinase.

Sandwich ELISA

Les dosages par Sandwich ELISA quantifient l’activité kinase à l’aide d’interactions anticorps-antigène. Ils sont rapides, sensibles, économiques et fournissent des informations sur la spécificité du substrat.

Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS/MS)

La LC-MS/MS permet l’identification de la phosphorylation des protéines sans biais. Il est utilisé pour l’identification à grande échelle des peptides phosphorylés et la localisation des phosphosites.

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